生命學院姚駿課題組發現突觸囊泡停泊初始態發生的過程及其分子機制


清華新聞網3月17日電 神經元之間的信號傳遞是大腦最基礎的生理活動,當動作電位到達突觸時,突觸小泡在毫秒級的時間內釋放神經遞質,從而使動作電位快速跨突觸傳遞,這一過程受到特定蛋白質機器的精密調控。突觸小泡與質膜的融合可分為停泊(Docking)、點火(Priming)和融合(Fusion)三個過程。停泊作為囊泡融合的起始階段,其重要意義在於大腦的神經活動並不是以單個的動作電位發生的,而是以十分高頻率的一串動作電位的方式進行,這就要求突觸有一批能快速釋放的囊泡在時刻準備着。囊泡的即刻可釋放池(RRP)保障了這一功能,並作為決定突觸強度的首要因素,影響着神經元和大腦許多重要的功能,而停泊這一過程是囊泡進入即刻可釋放池的初始步驟,其如何發生、由誰介導,目前尚無定論。

在文獻報道中,Synaptotagmin-1 (Syt1)和三個SNARE蛋白形成的複合物,是介導突觸小泡停泊的潛在候選分子機器。SNARE複合物由三個蛋白組成,是囊泡與質膜融合的最小蛋白機器。Syt1則是動作電位誘發突觸小泡釋放的鈣離子感受器。在經典的囊泡融合模型中,三個SNARE蛋白在遠端結合形成一個Z字型的拉鍊,隨着4個平行α螺旋束結構的形成,囊泡自遠而近地完成了停泊-點火(Docking-Priming)的過程,進入準備釋放(release ready)的狀態,這是囊泡停泊的傳統模型,即SNARE complex介導了囊泡的停泊。然而,這一模型存在較大爭議,原因在於兩方面。一方面,停泊的形態學定義(即囊泡須緊貼於質膜)並不準確,停泊究竟在什麼位置啓動,一直是懸而未決的問題。另一方面,在蛋白機器研究上,多重基因敲除動物模型不但耗時耗力,而且存在很多發育缺陷與代償作用帶來的負面效應。

為解決上述技術障礙,姚駿課題組開發了在體高效沉默多重基因的CRISPRi技術,在神經元中,高效特異地對基因單獨或者聯合進行條件性敲低,在神經元內構建出類體外重構的環境。另外,課題組結合高壓冷凍(High pressure freezing)與電子斷層掃描(TEM tomography)技術,得到接近真實狀態下神經元突觸不同基因敲除的三維電鏡數據。從而對突觸小泡的停泊過程進行精確的電鏡觀測和定義。作者首先對SNARE複合物進行了多重敲低,發現在離突觸前膜2-12 nm的範圍內,突觸小泡出現了數倍於對照組的聚集。在SNARE全敲的基礎上引入Syt1敲低後,突觸小泡的聚集現象消失,這説明Syt1可能是將囊泡圈定在2-12 nm範圍內的關鍵因素。隨後的一系列實驗全面證實了Syt1的這一功能。進一步,作者們開始探索Syt1啓動突觸囊泡停泊的分子伴侶。脂質體共沉澱實驗(co-sedimentation)表明,Syt1可以通過其C2B domain上的K325-K327模塊與PIP2結合,突變這一模塊(Syt1KA),Syt1則無法與PIP2相互作用。而Syt1與SNARE結合有兩個界面,同時突變這些界面位點(Syt1Q/LLQQ),可以有效地減弱Syt1與SNARE的結合。作者發現,在Syt1/SNARE敲低組中引入Syt1KA突變體,並不能讓突觸小泡被圈定在2-12 nm範圍內,而Syt1Q/LLQQ卻可以執行這一功能。所以,Syt1很可能通過與PIP2結合來啓動突觸小泡停泊。針對PIP2的功能研究,作者們使用了四種不同的方法來降低或提升突觸前膜上PIP2的含量,包括PIP2合成酶PIP5K三個亞型的三重敲降、PIP2水解酶Synaptojanin-1 (Synj)的增強型突變,以及代謝型穀氨酸受體mGluN5的拮抗劑和激動劑處理。這四種方法均有效地改變了突觸前膜上PIP2的含量。此外,電鏡分析結果表明,降低PIP2含量可抑制Syt1在2-12 nm處啓動突觸小泡的停泊,而提升PIP2含量則無明顯效應。這一系列實驗,證明了PIP2是Syt1在膜上的分子伴侶,它們相互作用、共同啓動了突觸小泡的Docking。

綜合來看,本項研究發現Syt1結合PIP2介導了突觸小泡的停泊的起始過程,其作用位置位於距質膜約12 nm處,該過程不依賴於SNARE複合物,且優先於SNARE複合物的形成。通過這一研究,作者們發現了Docking起始態發生的位置和分子機制,為理解神經遞質的釋放過程,尤其是理解大腦在受到高頻生理刺激時神經元保持快速高效的響應,作出了重要貢獻。

突觸囊泡Docking的動態過程及其分子機制

此研究工作於3月16日在線發表於《細胞報道》(Cell Reports)期刊。清華大學生命學院姚駿研究員為本文的通訊作者。生命學院博士生陳運、王穎菡及生命學院已出站博士後鄭毅為共同第一作者。清華大學生命學院李雪明研究員及其課題組李美靜博士,姚駿課題組王秋文博士、博士生汪兵、付崇雷、劉要南為本項研究作出了重要貢獻。清華大學冷凍電鏡平台李英博士和胡曉風、細胞影像平台王文娟博士、NIBS何萬中研究員和尼康公司李勳博士為本研究提供了重要幫助。

論文鏈接://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)00156-X

供稿:生命學院

編輯:李華山

審核:呂婷

2021年03月17日 14:12:07  清華新聞網

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